Член-корреспондент РАН Л

Член-корреспондент РАН Л. И. Корочкин

Деловые стволовые

Интерес к стволовым клеткам возник потому, что появилась надежда с их помощью избавиться от разнообразных по происхождению, локализации и течению болезней, связанных с необратимым повреждением тканей и неизлечимых обычными способами. Это, например, болезнь Альцгеймера, при которой деградирует ткань мозга; диабет, вызванный порчей островков Лангерганса в поджелудочной железе; миопатия Дюшенна, при которой разрушается мышечная ткань; цирроз, связанный с перерождением печени, и множество других. Естественной регенерации в этих случаях не происходит, или она недостаточна. Лечить такие болезни трансплантацией органов тоже не всегда возможно. Идеальным выходом из положения была бы пересадка клеток, способных замещать повреждённые клетки и восстанавливать испорченные органы.

Однако и этот путь не прост. Большую часть любого органа взрослого организма составляют дифференцированные клетки, структура и функция которых окончательно определились. Они не способны делиться, и пересаживать их бессмысленно: даже если иммунная система реципиента их не отторгнет, они не смогут восстановить больной орган, его нервную и кровеносную инфраструктуру.

Рис. 1. Стволовые клетки эмбриона в питательной среде (А). Через 10 дней из них формируются нейросферы (В) (Препарат Р.А. Полтавцевой, Институт биологической медицины РАМН)

Другое дело — клетки, способные к размножению. Они встречаются, вероятно, во всех органах. У некоторых способности к превращениям в клетки других типов и к размножению весьма ограниченны, и они не могут восстановить повреждения. Однако есть и менее дифференцированные клетки с большим потенциалом развития — это выяснилось в последние годы. Их назвали стволовыми, потому что из них, как ветви из ствола дерева, получаются клетки многих других типов. На них-то и возлагают сейчас огромные надежды врачи. Предполагается, что в тех случаях, когда клетки, ткани или органы необратимо повреждены, можно будет брать стволовые клетки донора или самого больного, размножать их в искусственной среде и вводить в организм. Там они должны дать начало непосредственным предшественникам дифференцированных клеток разных типов, чтобы те делились, превращались в специализированные и замещали утраченные.

Стволовых клеток очень мало, и выделить их непросто. Легче всего их получить из крови или костного мозга. Кроме того, источником стволовых клеток может быть плацентарная кровь, которая сейчас пропадает без всякой пользы. Стволовые клетки независимо от происхождения можно замораживать и длительное время хранить в банках клеток.

Уже давно известно об эмбриональных стволовых клетках, или ЭСК. Это клетки зародышей, находящихся на самых ранних стадиях развития. Они дают начало всем тканям и органам взрослого организма; могут превращаться, например, в нейробласты, из которых затем образуются нейроны, или в эпидермобласты, которые образуют кожу.

Долгое время учёные предполагали, что клетки с таким широким потенциалом существуют только на самых ранних этапах эмбрионального развития. Но вот гистолог Александр Яковлевич Фриденштейн в 70-е годы прошлого века открыл, что и во взрослом организме в костном мозгу есть клетки, способные давать различные производные, например эритроциты или лейкоциты, в зависимости от условий.

Рис. 2. Клетки, развивающиеся в нейральном направлении, окрашенные с использованием специфических маркёров. а, б — реакция на fi-тубулин (тёмная окраска); в, г — реакция на нейрофиламенты. (Препарат Е.А. Щегельской, Институт криобиологии НАЛУ, Харьков)

До него считали, что у клеток красной крови свой источник, своя стволовая клетка, у клеток белой крови — свой источник и так далее, а ему удалось опровергнуть это мнение. Он доказал, что и эритроциты, и лейкоциты могут образовываться из одних и тех же недифференцированных клеток.

А в последние годы выяснили, что клетки, способные развиваться в самых разных направлениях, сохраняются во многих органах взрослого организма. Они есть даже в головном мозгу. Это особенно удивительно, поскольку долгое время биологи и врачи повторяли: „Нервные клетки не восстанавливаются“. Нельзя сказать, что весь мозг нафарширован стволовыми клетками, но есть области, где они концентрируются, — это субвентрикулярная область и гиппокамп. Стволовые клетки можно оттуда изолировать и выращивать (культивировать) в определённой среде, где они размножаются. Затем с помощью разных веществ-индукторов вызывают их дифференцировку в разных направлениях, то есть превращение в различные морфологически и функционально определившиеся клетки. Можно, например, подействовать на них ретиноевой кислотой и заставить дифференцироваться в нейробласты или подобрать другой набор индукторов, и тогда они превратятся в клетки глии, питающие и обслуживающие нейроны.

В последнее время появляются совсем удивительные данные о том, что такие производные можно получить не только из стволовых клеток головного мозга, но и из так называемых стромальных стволовых клеток костного мозга. Мы с коллегами из харьковского Института криобиологии показали, что стромальные клетки мышей и даже человека можно культивировать и, воздействуя на них ретиноевой кислотой, превращать в клетки нервной ткани, в частности нейробласты и глиобласты (рис. 2). Мы установили это с помощью маркёров — специфических белков, которые свойственны только нервным клеткам или только глиальным. У них, как и у любых других клеток, разные гены экспрессируются по-разному, и в результате появляются разные белки. Такие белки можно определить с помощью меченых антител.

В общем, мы убедились, что дифференцировка стволовых клеток в нейральные действительно происходит. Это очень важно, потому что такие клетки можно использовать для трансплантации: выделить их, причём не у донора, а у самого пациента (например, из ребра), вызвать их дифференцировку и получить набор клеток, которые можно затем ввести в головной мозг.

М.А. Александрова (Институт биологии развития) вводила стволовые клетки мозга человека крысам. Эти клетки спокойно выживают, мигрируют, куда надо. Если они окажутся в мозжечке, то способны к превращению в клетки Пуркинье, специфичные для этого отдела мозга (рис. 3).

Для того чтобы пересаживать стволовые клетки, их нужно уметь опознавать, выделять и подсчитывать. Дифференцированные клетки определяют под микроскопом по форме и по цвету после специальной окраски. А вот стволовые, или так называемые прогениторные, клетки (клетки-предшественники, образующиеся на следующем этапе дифференцировки), или властные клетки (они образуются из прогениторных клеток), морфологически различаются плохо, и с ними работают по-другому.

Я уже упоминал, что у них, как и у всех других клеток, есть специфические белки-маркёры. По ним-то и можно определить, что это за клетка стволовая, прогениторная, глиобласт, нейробласт, эпидермобласт или что-то ещё. Есть специальные приборы, проточные цитофлуориметры-сортеры, которые разделяют на группы клетки, меченные флуоресцентными метками.

Рис. 3. Микросрезы мозжечка крысы, иммуногистохимически окрашенные на калбиндин — маркёр клеток Пуркинье в мозжечке. Округлые тёмные образования вверху — клетки Пуркинье. Внизу — эмбриональные клетки мозга человека, трансплантированные крысе в мозжечок. а — голубым цветом выделены ядра трансплантированных клеток в ультрафиолете (флуоресцентный краситель — бис-бензимид). б — вытянутые незрелые клетки мигрируют из мест трансплантации на постоянные места. (Препарат А.В. Ревищина, Институт биологии гена, и М.А. Александровой, Институт биологии развития)

Например, если в клетке есть белок нестин, то это стволовая клетка.

В прогениторных клетках — другой белок, виментин. В нейробластах — бета-3-тубулин и нейрофиламенты. В глиобластах — так называемый GFAP — глиофибриллярный кислый белок. Используя такой набор маркёров, можно определить эти клетки и подсчитать их количество.

Подобную работу мы проводили в нашей лаборатории вместе с лабораториями Геннадия Тихоновича Сухих из Института биологической медицины и Марии Анатольевны Александровой из Института биологии развития. У них хорошо налажено культивирование нейральных стволовых клеток человека, а мы изучали популяции, которые они получали в культуре: смотрели соотношение различных клеток, как они себя ведут, насколько гетерогенны. Попав в культуру, клетки собираются в скопления — нейросферы. В них есть клетки, развивающиеся как в нейрональном, так и в глиальном направлении (рис. 1, 4, 5, 6, 7)

Дифференцировка — процесс необратимый, точнее, обратимый только на некоторых стадиях. Ей предшествует детерминация — определение клеточной судьбы. Оно происходит ещё тогда, когда нет внешних признаков дифференцировки, нет даже характерных для неё белков. И тем не менее наступает момент, когда судьба клетки уже определена. Это состояние предопределённости клеточной судьбы и носит название детерминации. Она проходит через несколько стадий, и в конце концов так называемая терминальная (последняя) стадия детерминации автоматически переходит в дифференцировку. На ранних этапах детерминация лабильна, то есть на неё можно повлиять. Скажем, клетка, детерминированная к развитию в направлении нейробласта, на какой-то стадии под влиянием специфических индукторов ещё может стать глиобластом. Но наступает момент, и детерминация становится стабильной, необратимой: пойти обратно она уже не может.

Рис. 4. Культура клеток мозга человеческого эмбриона после 10-дневного культивирования в бессывороточной среде и 3-дневного — в среде с сывороткой. Нейросфера осела на дно, начала дифференцироваться. Слева — то, что осталось от нейросферы; оранжевые волокна — астроциты (глиальные клетки), окрашенные на глиофибриллярный кислый белок (GFAP). (Препарат А.В. Ревищина)

Рис. 5. Микросрезы нейросфер. Слева — стволовые клетки, справа — предшественники астроцитов. (Препарат А.В. Ревищина)

Пока до конца неясно, с какими событиями на молекулярном уровне это связано. Мы с лабораторией Георгия Павловича Георгиева из Института биологии гена и группой Григория Николаевича Ениколопова из Института молекулярной биологии смогли приблизиться к пониманию молекулярных механизмов детерминации в одном конкретном случае. За детерминацию отвечают специфические гены, и детали этого процесса очень сложно выяснить.

Великий биолог Август Вейсман ещё в позапрошлом веке предполагал, что по мере дифференцировки разные клетки утрачивают различные части хромосом. А теперь мы знаем, что в кодирующей части ДНК никаких преобразований не происходит, но возможны изменения в её „незначащей“ части, особенно в так называемых коротких повторяющихся последовательностях (сателлитной ДНК). У дрозофилы есть несколько фракций таких последовательностей, и в разных органах может преобладать та или иная из них, а в некоторых они полностью отсутствуют.

Раньше считали, что это ненужная ДНК, мусор, но на самом деле от сателлитной ДНК многое зависит в функционировании генома. Во-первых, она иногда определяет время включения гена. Это может повлиять на начало образования органа, и он окажется гипертрофированным или недоразвитым. Во-вторых, от наличия повторяющихся последовательностей, по-видимому, зависит связывание ДНК с ядерной мембраной. А это также отражается на работе генов. Вставка или выпадение определённых участков генома способны привести к тому, что ДНК свяжется с мембраной в новом месте или, наоборот, оторвется от неё. Или ещё пример. Известно, что повторение некоторых триплетов (тринуклеотидов) вызывает различные заболевания, так называемые болезни экспансии. Одно из них — мозжечковая атаксия — тяжёлое заболевание нервной системы, при котором нарушаются движения больного.

Рис. 6. Нейросферы. Антитела на GFAP с флуоресцентной меткой. (Препарат А.В. Ревищина)

Именно потому, что дифференцировка — сложный и плохо изученнный процесс, мне кажется неоправданным безмерный оптимизм в отношении клонирования млекопитающих. Тот небольшой процент успеха, который есть, связан, по-видимому, с тем, что в яйцеклетку иногда попадают ядра стволовых клеток. Попало ядро стволовой клетки — животное удаётся довести до взрослого состояния. Я могу повторить то, что уже писал для „Химии и жизни“: клонирование человека на запчасти — это маниловщина и способ выкачать как можно больше денег на работы, которые, возможно, имеют к этому делу лишь косвенное отношение. Я считаю, что назрело время, когда должно быть жёсткое законодательство и у нас, и за границей, чтобы Государственная Дума запретила всякие манипуляции с живыми человеческими зародышами. Это аморально и в научном отношении совершенно ненужно.

Рис. 7. Нейросферы, обработанные меченными антителами к GFAP (красный цвет) и в-тубулину (зелёный цвет). (Препарат А.В. Ревищина)

Трансплантировать же больным эмбриональные стволовые клетки самых ранних зародышей (на стадии бластоцисты) тоже рискованно и часто вредно. Во-первых, эти ранние клетки подвержены генетическим нарушениям. Во-вторых, при трансплантации они вызывают гибель соседних клеток хозяина. И в-третьих, пересадка этих клеток, как правило, заканчивается образованием опухолей.

Так что гораздо лучше работать со стволовыми клетками взрослого организма. В идеале их нужно выделять у самого пациента, чтобы не было реакции отторжения и они лучше приживались. Удобнее всего — из костного мозга. Затем эти клетки могут развиваться в самых разных направлениях, если обрабатывать их определённым индуктором. Наборы таких индукторов известны ещё из экспериментальной эмбриологии, их десятки. Известно, чем нужно подействовать, чтобы началось развитие нервной ткани, кишечника и так далее. Многие из этих белков выделены в чистом виде.

Врачи, а теперь и общество ждут многого от трансплантации стволовых клеток. Конечно, это будет прорыв в медицине, который позволит излечивать многие болезни. Но пока нужно получше разобраться, что возможно и что невозможно делать стволовыми клетками. Без новых исследований тут не обойтись.

„Химия и жизнь — XXI век“

http://wsyachina.narod.ru/biology/stromal_cell_6.html

В мире, где охотится смерть, нет времени для сомнений и сожалений. Время имеется только для того, чтобы принимать решения.

— К. Кастанеда

Текущий интерес к стволовым клеткам обусловлен их потенциалом для терапевтической трансплантации специфических здоровых клеток, тканей и органов людям, страдающим от различных заболеваний. Классическими стволовыми клетками являются клетки красного костного мозга, которые дают начало всем типам клеток крови. Они названы зрелыми, поскольку присутствуют также у взрослых особей, и могут дифференцироваться во многие, но не все типы соматических клеток, поэтому называются – плюрипотентными. Однако в течение первых двух недель развития человеческого эмбриона существует универсальная стволовая клетка – типопотентная, способная дифференцироваться в любой из ~260 типов человеческих соматических клеток. Эта стволовая клетка называется зародышевой (эмбриональной) стволовой клеткой (Embryonic Stem Cell). Последние достижения технологии переноса ядра (см. ниже) предоставляют альтернативный путь получения стволовых клеток, которые могут использоваться для трансплантации тканей и органов с минимальным риском отторжения трансплантата. Эта процедура называется терапевтическим или нерепродуктивным клонированием, в результате которой получают типопотентные ES клетки, являющиеся наследственно идентичными с клетками реципиента трансплантата.

Рассмотрим более подробно технологии, позволяющие создавать пациент-специфические эмбриональные стволовые клетки (ES):

1. Перенос ядра соматической клетки (Somatic Cell Nuclear Transfer)

В этом методе, обычная соматическая клетка (например, клетка кожи), располагается около яйцеклетки, чья ядерная ДНК удалена. Под воздействием небольшого электрического импульса они сливаются, и активизируется яйцеклетка. Ооциста перепрограммирует ДНК соматической клетки, переводя её в зародышевое состояние, и та начинает делиться. После нескольких дней, клетки формируют бластоцисту (микроскопический шарик из 100-250 клеток). Из бластоцисты, зародышевые стволовые клетки изолируются, и в дальнейшем выращиваются для дифференцирования в необходимые типы клеток.

Клетка пациента "сплавлена" с энуклеированной донорской яйцеклеткой, используя технологию переноса ядра. Зародышевые стволовые клетки изолируются из получившегося клона, и затем дифференцируются in vitro в генетически идентичные реципиенту клетки и ткани для пересадки.

Открытие технологии трансплантации ядра соматической клетки предоставило одну из наиболее универсальных и ценных технологических основ в истории биотехнологий. Одно из преимуществ технологии SCNT в том, что клонированные клетки "омоложены" – теломеры, которые укорачиваются у зрелых клеток, что приводит в дальнейшем к их старению и гибели, удлиненны до первоначального состояния. Следовательно, эта технология позволяет создавать омоложенные здоровые клетки для пересадки, которые генетически идентичны собственным клеткам пациента.

Важно понять, что терапевтическое клонирование кардинально отличается от репродуктивного клонирования, целью которого является создание человеческого эмбриона с последующей подсадкой его в матку. При терапевтическом клонировании никакой жизнеспособный зародыш не создаётся и не уничтожается! Дело в том, что только одной массы эмбриональных клеток недостаточно для формирования полноценного эмбриона, т. к. в этом процессе принимают участие и некоторые другие эмбриональные клетки.

2. Партеногенез

В этой технологии не используется соматическая клетка. Берут только яйцеклетку пациента и стимулируют её специальными методами, приводящими к её активации, последующему делению и формированию зародыша, из которого может быть получена культура эмбриональных стволовых клеток. Эта многообещающая технология с точки зрения эффективности, к настоящему времени имеет один недостаток, обусловленный необходимостью получения яйцеклетки, и таким образом для целей аутогенной пересадки ограничен только женщинами, способными к овуляции. Тем не менее, ведутся исследования направленные на то, чтобы сделать эту технологию применимой ко всем женщинам, а также пациентам мужского пола. В 2002 году в журнале Science (295:819) сообщалось об успешном партеногенезе у приматов с последующим выращиванием дофаминергических нейронов для лечения болезни Паркинсона.

3. Перенос ооцитоплазмы

В этой технологии, вместо передачи ядра соматической клетки в ооцисту, выполняется обратное. Цитоплазма яйцеклетки сливается или впрыскивается в соматическую клетку. Выращиваемые в специальной среде клетки являются источником получения эмбриональных стволовых клеток. Эта технология находится в более раннем состоянии разработки, чем SCNT, но может обеспечить определенные преимущества как, например, более низкий профессиональный уровень, необходимый для перепрограммирования человеческих клеток.

4. Трансдифференцировка (Transdifferentiation)

Так же, как цитоплазма яйцеклетки способна переводить любую клетку в зародышевое состояние, аналогично, цитоплазма одного типа клеток (например, клетка крови) способна перепрограммировать другой тип клеток (например, клетки кожи) в свой. Эта технология, впервые опубликованная в 2002 году в Nature Biotechnology (20:460), позволяет клонировать клетку, взятую у пациента, в другой тип клеток, генетически идентичных пациенту. Пока эта технология используется не так широко и успешно, как SCNT, однако трансдифференцировка может иметь большие перспективы в сочетании с SCNT, чтобы создавать, например, клетки поджелудочной железы для лечения сахарного диабета.

5. Технология дифференцирования стволовых клеток

Регенеративной медицине необходимо, чтобы стволовые клетки независимо от способа их получения, дифференцировались (или редифференцировались) в специфические типы соматических клеток, и затем трансплантировались обратно пациенту. Дифференцирование в ткани, такие как, сердечная мышца, кровь или другие, происходит спонтанно в процессе культивирования эмбриональных стволовых клеток на средах. Также некоторые химические вещества, например, ретиновая кислота, могут быть использованы для инициирования дифференцировки в специфические типы клеток, например, в нервные клетки. Способы управления ростом стволовых клеток, дифференцированием культуры являются важными на сегодняшний момент сферами исследования многих компаний.

***

ES клетки как источник для трансплантации не лишены собственных потенциальных проблем. Так, например, рост человеческих ES клеток в культуре требует «питательного» слоя клеток мыши, которые могут содержать опасные вирусы, кроме того, при дифференцировке ES клеток может сформироваться смесь нескольких типов клеток. Человеческие ES клетки при введении их подопытным мышам могут формировать доброкачественные опухоли, хотя этот потенциал, возможно, исчезает, если клетки предварительно подвергнутся дифференцировке перед введением в реципиента. Однако исследования ES клеткок показали многообещающие перспективы в лечении сахарного диабета, болезни Паркинсона и травм спинного мозга.

Вероятно, что эмбриональные стволовые клетки будут первоначально использоваться для трансплантации отдельных типов клеток, например, мышечных или нервных клеток. В будущем, благодаря их способности давать начало всем типам клеток, они могли бы использоваться для создания тканей и, теоретически, сложных органов для трансплантации. Но это будет требовать значительного совершенствования методов, осуществляющих направленную специализацию ES клеток в каждый из составляющих этот орган тип клеток, а затем «сборку» их в правильных пропорциях и пространственную организацию. Это может быть относительно несложно для простой структуры, типа панкреатического островка, вырабатывающего инсулин, но весьма затруднительно для таких органов, как легкие, почки или печень.

Полученные из эмбриональных стволовых клеток линии специфических клеток (и, если возможно, тканей и органов) для терапевтической трансплантации могут столкнуться с проблемой отторжения трансплантата. Эксперименты с моделями на животных показывают, что наличие «рассеивающихся» митохондриальных белков в клетках может создать «незначительные» антигены трансплантации, которые могут вызвать отторжение; это не было бы проблемой, если бы яйцеклетка была получена от матери реципиента трансплантата или реципиента непосредственно. Для некоторых аутоиммунных заболеваний, трансплантация клеток, клонированных от собственных клеток пациента может быть нецелесообразна, т. к. эти клетки будут целями для продолжающегося деструктивного процесса. Кроме того, как и при использовании аутогенных зрелых стволовых клеток, в случае генетических нарушений, зародышевые стволовые клетки пациента несут тот же самый дефект и должны быть выращены и наследственно изменены прежде, чем они будут использоваться для терапевтической трансплантации

http://www.medbiotech.info/biotech/clon_therap.html

Выйти из клетки

Людмила Колбина

В Екатеринбурге на базе Института медицинских клеточных технологий создают Международный научный центр по изучению и применению стволовых клеток. Его приоритетом станут собственные разработки уральцев

Фото: Андрей Порубов

На экране в кабинете министра международных и внешнеэкономических связей Свердловской области Виктора Кокшарова — крупным планом пульсирующее сердце мыши, причем его сегменты разных цветов. Профессор Кельнского университета Юрген Хешелер тычет в сердце лазерной указкой:

— Мы доказали, что возможно создание новых сердечных клеток путем комбинирования генной терапии и терапии стволовых клеток. Мы искусственно вызывали у мышей инфаркт, затем вводили стволовые клетки и наблюдали, как пораженные клетки сердечной мускульной ткани замещаются здоровыми. Затем эти новые мышцы начинают сокращаться, видите — выделены цветом. Через некоторое время сердце работает как до инфаркта. Мы интегрировали в эмбриональные стволовые клетки наночастички и отслеживали, как эти меченые клетки функционируют. Мы можем вырастить любое количество сердечных клеток, хоть килограмм, что очень важно для транспортировки. Технологии, которые мы разработали на мышах, можно перенести на человека. Это медицина будущего, неизлечимые болезни исчезнут…

Немец предложил уральским исследователям стволовых клеток, присутствовавшим на встрече с министром, объединить усилия в совместном проекте. Стороны тут же обсудили детали создания на базе Института медицинских клеточных технологий в Екатеринбурге Международного научного центра по изучению и применению стволовых клеток. Министр заявил: «Будем считать, камень в основание российско-германского центра положен. Важно создавать свои конкурентоспособные технологии». И заверил: правительство центр поддержит.

Студент пятого курса медакадемии Александр Попов уже редкий специалист: методом точной цветофлюориметрии он умеет различать и считать стволовые клетки

Фото: Андрей Порубов

— Губернатор Эдуард Россель инициировал создание нашего института в 2005 году после того, как один московский доктор наук три часа рассказывал ему, на что способны стволовые клетки, — поведал корпоративную легенду директор института Семен Спектор. — Эти прорывные технологии изменят нашу жизнь. В институте уже внедрены уникальные методики, позволившие добиться результатов, не возможных прежде. Проведены операции. Есть три основных направления, которыми реально сейчас занимается медицина мира и Институт медицинских клеточных технологий в Екатеринбурге. Во-первых, стволовые клетки определяют возможность восстановления органа после повреждения. Во-вторых, борьба со старением организма: оно обусловлено тем, что иссякающий с возрастом запас стволовых клеток прекращает генерировать новые клетки органов, а те постепенно перестают выполнять свои функции. Третье направление — онкологическое: после разрушения опухоли на освободившемся пространстве должны возникнуть новые клетки…

Для чего нам продвинутые немцы, ясно: центру потребуются апробированные технологии, хорошие связи с европейским сообществом. Юрген Хешелер — как раз координатор проектов двух европейских консорциумов, президент Всегерманского общества исследований стволовых клеток, признанный специалист в этой области. Вскоре запускается седьмая рамочная программа, по которой ЕС на эти исследования выделяет 61 млн евро, и центр мог бы в нее вписаться. Но зачем мы немцам? Профессор элегантно сетовал: в Германии, как и в ряде других стран, исследователи натыкаются на юридические ограничения. Родилась версия: потомуто и заниматься переносом результатов с мышей на людей немцы предложили в непуганой законами России. Да не в Москве и Питере, на виду у законодателей, а где подальше — на Урале.

Лариса Фечина спасает младенцев

Стволовая клетка. Выглядит совершенно невзрачно

Фото: Андрей Порубов

Мне возразили: ученых, исследующих стволовые клетки, не более тысячи в мире. Все наблюдают за результатами друг друга. И их похорошему тянет к объединению усилий: чтобы поскорей. Знание, добытое одними, укрепляет и ускоряет других. Чтобы эффективно использовать клеточную терапию, необходим кооперативный опыт. «Я знаю все, кто и что по моей теме сделал: американцы, европейцы, японцы. Держу руку на пульсе. Необходимо сверять результаты, не замыкаться, тогда и ты выдашь интересный продукт», — говорит детский онколог Лариса Фечина.

Пока для Института медицинских клеточных технологий разрабатывается проект собственного здания, он размещается на территории госпиталя ветеранов войн, а большинство из его 48 сотрудников занимаются исследованиями «на своих площадках». Замдиректора института Лариса Фечина возглавляет супероснащенный Центр онкологии и гематологии областной детской клинической больницы № 1, построенный год назад. Здесь стали возможны новые способы диагностики и лечения детей с тяжелыми онкологическими заболеваниями, которым обычная химиотерапия и хирургия помочь не могли, а таких — 70%. 30 октября в центре, впервые на Урале, провели первую успешную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток трехлетней пациентке. А уже 18 декабря здоровая малышка, прежде не имевшая шансов на спасение, вернулась домой. Первый опыт — и сразу окрыляющий успех.

— Мы должны были гарантировать для пересадки живые клетки в достаточной концентрации, иначе они бы не прижились, — рассказывает Лариса. — Костный мозг не был поврежден, поэтому стволовые клетки мы взяли у самой девочки. Клетки хранятся при минус 175 градусах в парах жидкого азота. Процесс глубокой заморозки сложен, требует плавного многоступенчатого понижения температуры. Мы теряем только 7% клеток: это очень хороший результат. Отработали индивидуальный протокол заморозки, проведя 20 пробных сеансов, прежде чем получили оптимальный режим.

Когда мы заморозили стволовые клетки и убедились, что их на хранении находится нужное количество, несколько дней проводили девочке очень высокими дозами химиотерапию. Так мы полностью погубили опухоль (у пациентки была примитивная нейроэктодермальная опухоль периферической нервной системы 4 степени). Но вместе с опухолью погибли и здоровые клетки костного мозга: способа разрушить ее, оставив нетронутыми здоровые клетки организма, не существует. После этого мы осуществили пересадку клеток, ввели их в периферическое кровяное русло со всеми реанимационными предосторожностями. Морально и технически мы были готовы к непредвиденным ситуациям, острым осложнениям.

Наступил тяжелый период ожидания: когда приживутся клетки. Это случилось на 14й день. Количество лейкоцитов в периферической крови увеличилось, содержание гранулоцитов превысило 500 клеток в одном микролитре крови. Это был сигнал: трансплантат прижился. Он обнаружился именно там, где был нужен. Стволовые клетки благодаря рецепторам обладают хоуминг-эффектом — умеют распознавать собственный «дом». Они направились в костный мозг, прижились и дали начало новому здоровому пулу кроветворных клеток. Через месяц девочка была выписана домой в хорошем состоянии…

Технологии, изумляющие результатами, требуют высокой компетенции персонала и полного перевооружения сегмента медицины, в котором работает доктор Фечина. Центр открылся 3 февраля прошлого года, девять месяцев ушло на освоение технологий. Теперь врачи наращивают объемы и темпы. Недавно, 4 января, проведена вторая трансплантация — двухлетнему мальчику с неблагополучной формой рака печени. Клетки перелиты, теперь ждут приживления. В ближайшее время предстоит трансплантация 15летнему подростку.

В лаборатории первичной обработки стволовых клеток начинается их путь к будущей трансплантации. Здесь соблюдаются правила особой чистоты помещений для работы с живыми культурами, предъявляемые в международной практике: поддерживаются особый уровень микрочастиц, давление, вентиляция. Персонал сюда попадает через специальные шлюзы. Снимать лабораторию нам разрешили только через тройное стекло

Фото: Андрей Порубов

«Пока центр строился, мы учились за рубежом. Мой принцип: учись сама и учи команду. Если ученый будет один, ничего хорошего не получится», — уверена доктор Фечина. Своим учителем она считает Фрица Ламперта: немецкий ученый с мировым именем много сделал, чтобы подготовить клинику в Екатеринбурге к интеграции в мировую систему. Сейчас они ведут совместные эксперименты.

Принципиальное отличие лечения стволовыми клетками в Екатеринбурге от московского и питерского заключается в том, что тут на одной площадке впервые создали замкнутый цикл. Проводится вся первичная диагностика, заготовка клеток, трансплантация, лечение и дальнейшее наблюдение. Для Свердловской области открылась возможность больше не направлять пациентов в столицу. Потребность в операциях по трансплантации детям стволовых клеток в РФ — 1500 в год. С учетом подростков цифра удваивается. А Москва и СанктПетербург проводят в год не более сотни пересадок. Дети из регионов если и попадали в большую очередь, большинство из них не доживало до операции. Сегодня центр полностью закрывает потребность Екатеринбурга, Свердловской области и тюменского севера. И мог бы в рамках федеральных квот лечить детишек из других территорий, но для этого должен быть решен вопрос выделения таких квот. Это очень затратные технологии, и финансовая нагрузка не может лечь только на плечи бюджета и ТФОМСа Свердловской области. Для пациентов все виды лечения смертельных заболеваний бесплатны.

Главный итог: команда доктора Фечиной создала протокол для лечения младенцев с острыми лейкозами — подробнейшую программу диагностики и лечебных мероприятий, в которой указывается каждый шаг до мельчайших деталей. Это книга размером с хорошую монографию, интеллектуальная собственность. Но у исследователей нет цели продавать программу. Их задача — убедиться в эффективности способа и внедрить его. Собственно, по нему уже лечат пациентов в Москве, СанктПетербурге, Минске. Исследование включено в перечень исследований Института медицинских клеточных технологий.

Фечина хотела бы, чтобы Россия имела в лечении таких заболеваний приоритет мирового уровня. Но мировому медицинскому сообществу предложить этот способ Лариса не может: «Пока мы говорим о хороших промежуточных результатах».

И обозначает глобальную проблему — эффективность лечения стволовыми клетками в мире все еще под вопросом:

— Мы должны дождаться так называемых отсроченных результатов. Критерий — пять лет. Это 100% того, что у пациента действительно все хорошо.

Андрей Белкин и его восемь пациентов

Доктор медицинских наук, заведующий лабораторией клеточной терапии инсульта в институте и нейрохирургическим отделением в областной больнице № 40 Андрей Белкин рассказывает, как он вместе с другим неврологом Сергеем Леонтьевым был откомандирован в Лейпциг, в Институт иммунологии. Здесь экспериментально, на мышах, получили интересные результаты использования стволовых клеток при лечении острых инсультов. Но двигаться дальше законодательство Германии не позволяет, клинические исследования там связаны с большими сложностями. Поэтому, и Белкин это не отрицает, немцы вышли на нас. Вернувшись, профессора оказались на гребне конъюнктуры: губернатор Эдуард Россель решил открыть институт.

До поездки в Германию Андрей Белкин не занимался стволовыми клетками:

«Я сижу в огромной муниципальной клинике, второй в России по величине, в которой куча текущих проблем. Мы должны перерабатывать огромный поток пациентов». (Его раздраженность понятна: к кабинету Белкина пробираешься по коридорам, переполненным страждущими — и лежачими, и на ногах.) Но за исследование он взялся: «Если сейчас не начать — опоздаем, кто-нибудь сделает обязательно. Но вдруг на плохом уровне? Тогда запретят. Приедет Росздравнадзор и скажет: “Это что такое творится? Опыты на людях!”. Мне захотелось сделать это на хорошем уровне. А самое главное — любопытно: вдруг получится. Ведь в использовавшихся до сих пор методах лечения инсультов больших успехов нет».

Он решил модифицировать эксперимент в Германии и вынести его в клинику. Спроектировал с группой коллег план исследования в несколько этапов. По гипотезе, если в острейшем периоде развития ишемического инсульта* с помощью препарата N** стимулировать выход с током крови в больших концентрациях собственных стволовых клеток пациента в поврежденный орган, это позволит увеличить их защитный эффект, уменьшить зону повреждения и степень инвалидизации в последующем. Гипотезу отстояли на сессии Российской Академии медицинских наук. Дал добро на проведение такой работы и этический комитет 40й больницы.

Пациентов, которые бы обратились с инсультом в течение первых суток, подобрать было трудно. «Народ у нас вымрет от инсульта, потому что поздно обращается к врачам: когда помочь уже нельзя — полный паралич, — негодует Белкин. — Цивилизованное человечество мчится в больницу с инсультом в течение первых двух часов».

С трудом отобрали восемь человек.

В начали лета они прошли первый этап лечения стволовыми клетками в небольших дозах. Теперь в течение полугода врачи хотят убедиться, что это безопасно.

И начать второй этап: в конце весны предполагается уже большая, многократная стимуляция, которая должна привести к огромному выходу стволовых клеток. Дело в том, что после одного инсульта высока вероятность развития повторного. Выход большой концентрации клеток позволит заготовить их впрок на этот случай. Это будет третий этап: клетки выгнали, в костном мозге они потом образуются, но нужно время, которого у пациента может не быть. А хорошо, чтобы действие клеток пришлось на первые часы развития инсульта: человека привезли, быстро извлекли и влили его собственные стволовые клетки — тогда он спасен.

Леонид Савельев, заведующий лабораторным отделением Центра детской онкологии и гематологии: «Подготовленные к трансплантации клетки подвергаются программируемому замораживанию и длительному хранению при температуре минус 175 градусов в парах жидкого азота»

Фото: Андрей Порубов

Все восемь пациентов получают стандартное лечение плюс параллельно терапию стволовыми клетками: ни один этический комитет не позволил бы Белкину и его коллегам отказаться от уже установленного лечения и подвергнуть пациента риску в угоду чегото еще не известного. Кроме того, работает международное правило good clinical practice: хорошая медицинская практика предполагает, что люди документально дают согласие на исследование.

Клинически все пациенты сейчас демонстрируют положительную динамику. Стволовые клетки явно повышают эффективность обычной, стандартной терапии. Но выводы можно будет делать только через полгода. А переводить эксперимент в практику — через два-три года, после того, как другие врачи по одному и тому же протоколу повторят результат. Причем уральцы тут не одиноки. Параллельным курсом идут, дышат в ухо друг другу, корейцы и американцы.

— На переднем крае терапии стволовыми клетками мы не можем быть: надо иметь очень большой бюджет, — сокрушается доктор Белкин. — Создание Международного центра — это здорово, но воздушных замков я не люблю. Люди, которые замахиваются на очень дорогую технологию, должны понимать, что в нее надо и вложить очень много. Только страна с высоким уровнем развития и большим бюджетом здравоохранения, науки это вытянет. По прогнозам аналитиков, к 2012 году технологии уже будут доказаны как правомочные, а к 2020 году они серьезно начнут теснить традиционную медицину.

Сергей Сазонов создает клеточные линии

К клинической практике терапии стволовыми клетками, помощи конкретным людям, в Екатеринбурге смогли приступить во второй половине минувшего года, по мере разворачивания исследовательских программ нового института. Между тем изучением возможностей стволовых клеток на Урале занялись еще десять лет назад. Профессор, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой гистология, цитологии и эмбриологии в Уральской медицинской академии Сергей Сазонов имел к этому самое непосредственное отношение.

Тогда, в конце 90х, с помощью и подачи немецких ученых ему удалось отработать технологию распознавания стволовых клеток в том качестве, в каком она имеется в Соединенных Штатах, Германии, Франции: технология должна быть универсальной. Клетки распознают по наличию у них определенных рецепторов. Рецепторы — это «замок», к которому необходимо подобрать индивидуальный «ключ». Если подобрали правильно, можем сказать, что это клетка стволовая и какую способность к дифференцировке она имеет. Ключами с заранее известными свойствами является белок, который в медицине называется антиген. Опять же эти ключи универсальны во всем мире. Имея такой ключ, можно найти именно ту клетку, которая нужна.

В первую очередь это необходимо практическим врачам, которые занимаются лечением онкологических заболеваний, трансплантацией этих клеток больным после химиотерапии. Около десяти лет назад несколькими лабораториями нынешнего Центра детской онкологии и гематологии, основателем которых Сазонов и был, отрабатывалась не только диагностика, обнаружение этих стволовых клеток, но и сами технологии их забора, обработки и дальнейшей трансплантации. Это инструмент для того, чтобы проводить исследования. Инструмент должен быть стандартный.

В новом институте Сергей Сазонов возглавил научную лабораторию экспериментальной цитологии и эмбриологии. У нее два куратора в постановке новых технологий: Юрген Хешелер и доктор биологических наук Сергей Киселев из Института биологии гена РАН (Москва).

Лаборатория будет заниматься эмбриональными стволовыми клетками. У взрослого человека их по сути нет, поясняет Сазонов:

— Эмбриональные клетки не отторгаются в организме людей, которым их трансплантируют: на них еще очень мало тех самых рецепторов. Даже частично дифференцированная стволовая клетка при пересадке тут же выявляется и уничтожается как чужеродная: такова система контроля в организме человека. Близкого по рецепторам человека подобрать очень трудно. Поэтому и нужны линии эмбриональных клеток. Будем создавать свои, чтобы не покупать их на Западе. Совместно с Центром семейной медицины (Екатеринбург): у него достаточно эмбриологического материала, чтобы начать эту работу.

Где востребованы стволовые клетки?

В первую очередь в гематологии. Второе направление, которое будет их широко применять, — дерматология и косметология (клетки — ключ к омоложению). Третье — восстановление поврежденных органов. При хронических заболеваниях, например печени и почек, эмбриональные клетки при трансплантации могут дать популяцию клеток именно этого органа и, возможно, снимут так и не решенную в стране проблему с созданием банка донорских органов.

Надо подчеркнуть, что аналога научноисследовательского института, каким он планируется в Екатеринбурге, в России нет: институты в стране занимаются только клинической работой, то есть внедряют в лечебный процесс технологии, взятые на Западе. А уральский проект — комплексный: с лабораториями, в которых будет проводиться экспериментальная и исследовательская работа. Сделан акцент на разработке своих технологий, экспериментальной базы. Для этого необходим виварий с животными, на которых будут отрабатываться методики лечения. Должны появиться клиники, куда эти новые разработки передаются. Семен Спектор подчеркивает: «Если проект будет реализован так, как он задуман, институт будет самым передовым в России. Это именно государственное учреждение здравоохранения Свердловской области. Иначе немногие жители области смогут рассчитывать на его услуги».

http://www.expert.ru/printissues/ural/2007/05/stvolovye_kletki/

Сердце располагает собственными стволовыми клетками

Ещё в 2003-м исследователи из лаборатории Пьеро Анверсы (Piero Anversa) медицинского колледжа Нью-Йорка (New York Medical College) обнаружили стволовые клетки в сердцах мышей, а позже - и людей. Однако тогда они ещё не знали - возникли и проживали ли эти стволовые клетки фактически в сердце или только лишь мигрировали туда от другой ткани, типа костного мозга.

Теперь коллега Анверсы, Аннароза Лери (Annarosa Leri), используя взрослых мышей, определила местонахождение естественной "ниши" для стволовых клеток, которые, как оказалось, в особенном изобилии "водятся" в предсердии. Она нашла, что стволовые клетки группируются вместе с более зрелыми "ячейками", в промежутках между мышечными сердечными клетками.

Лери и её коллеги взяли крошечное количество сердечных стволовых клеток от людей, подвергавшихся операциям на сердце, вырастили их в лаборатории и затем пересадили в повреждённые сердца крыс и мышей.

Опыты показали, что, в конечном счёте, такие сердечные стволовые клетки могут дать лучшие результаты лечения сердца, чем стволовые клетки из костного мозга, которые уже как-то использовали для лечения сердца у пациентов-людей.

"Мы думаем, что это - те самые клетки, которые обычно обеспечивают рост новой сердечной ткани, и они лучше подойдут для ремонта больных сердец", - говорит исследовательница. Однако ещё потребуется много работы, чтобы выяснить точное происхождение и механизм "включения" данных клеток.

Автор

Подробности (inform@podrobnosti.ua) По материалам

Мембрана (http://www.membrana.ru)

URL новости http://www.podrobnosti.ua/health/2006/05/30/317401.html